基于高光谱成像技术单壁碳纳米管用于溶酶体脂质通量的监测

溶酶体是分解细胞内脂质、蛋白质、糖类及其他物质的细胞器，如果溶酶体分解机制发生“故障”，则导致底物（如脂质和糖蛋白）在溶酶体腔内积累，诱发溶酶体储存障碍类疾病（LSDs）。目前，因缺少对上述疾病的认知，已开发的用于治疗上述疾病的小分子还十分有限，且仅能测定细胞内脂质的含量。因此，开发出一种专门定位于溶酶体细胞器内腔并及时对脂质含量做出响应的探针极其迫切。单壁碳纳米管（SWCNTs）可以在近红外（NIR）区域发出窄带隙的高稳定性荧光，这类荧光对局部扰动十分敏感，可以通过溶剂化显色反应对局部微环境变化做出响应。基于此，2017年，DanielA. Heller教授课题组在《ACSNano》上发表了题为“ACarbon Nanotube Optical Reporter Maps Endolysosomal Lipid Flux”的文章，报道了其在小分子探针领域的取得的研究成果。在该论文中作者们构建了一种生物相容性良好的“光学报告器”，该报告器可以特异性定位在活细胞的溶酶体腔内，而对细胞器的形态、消化底物的能力、细胞活力、增殖没有影响。ss(GT)6-(8,6)对脂质含量变化的响应性作者们通过非共价键将SWCNTs与DNA结合在一起，采用高效液相色谱法（HPLC）对不同长度的SWCNTs进行分离，并通过低密度的脂质蛋白（LDL）诱导发射波长蓝移，筛选出具有较大蓝移位移的DNA-CNTs复合物，命名为ss(GT)6-(8,6)。借助于高光谱显微镜，获得了在七种不同溶剂环境中ss(GT)6-(8,6)复合物与溶剂介电常数的关系，证实了ss(GT)6-(8,6)复合物与溶剂介电常数相关，分子动力学模拟也表明低介电常数会使ss(GT)6-(8,6)复合物的发射波长蓝移（图1）。

图1. ss(GT)6-(8,6)对脂质的响应；（a）标准化吸收-发射光谱；（b）发射波长与胆固醇-PEG浓度的函数；（c）不同溶剂中的平均发射波长；（d）分子动力学模拟平衡结构示意图；（e）水分子密度与SWCNTs表面距离的函数作者们使用荧光显微镜对ss(GT)6-(8,6)复合物与哺乳动物细胞之间的相互作用进行了探究。将巨噬细胞置于含0.2 mg/L ss(GT)6-(8,6)复合物的10%血清(FBS)中培养，用新鲜的无复合物培养液冲洗，显微镜下巨噬细胞发出强烈的荧光，说明ss(GT)6-(8,6)复合物与细胞紧密结合在了一起，37℃之下培养的巨噬细胞的荧光强度是4℃下的十倍，说明细胞对于ss(GT)6-(8,6)复合物的内吞作用有很强的能量依赖性。ss(GT)6-(8,6)在细胞内的定位作者们对巨噬细胞进行了一系列的成像实验确定了ss(GT)6-(8,6)复合物在细胞内的位置。使用Cy3对DNA进行标记，分别在NIR和可见光区域对DNA-CNTs进行成像，两种情况下所观察到的荧光信号在细胞内的位置相同，说明结合到CNTs上DNA是定位CNTs的可靠指示剂。然后作者们用Lyso Tracker Green对Cy5标记ss(GT)6-(8,6)复合物进行定位，结果表明Cy5和Lyso Tracker Green之间存在共域化，皮尔逊相关系数为0.92 ± 0.036，曼德斯分裂共域系数为0.95 ± 0.018，说明CNTs的发射信号源在溶酶体内腔，另外，CNTs的NIR发射源位置与Lyso Tracker Green发射源位置相同，这在一定程度上也支撑了上述结论。Au纳米颗粒标记CNTs的TEM图也表明CNTs位于溶酶体腔内（图2- 4）。

图2：Cy3标记的ss(GT)6-(8,6)复合物在NIR和可见光区域的荧光成像

图3：Cy5标记的ss(GT)6-(8,6)和Lyso Tracker Green在活细胞内的荧光成像

图4：ss(GT)6-(8,6)在细胞内的定位；（a）Cy5标记的ss(GT)6-(8,6)和Lyso Tracker Green在活细胞内的荧光成像；（b）TMR-dextran和Alexa-647-SWCNT在U2OS-SRA cells中的共聚焦成像；（c）高斯拟合之后的TMR和Alexa 647的强度分布图；（d）AuNP−SWCNT的TEM图像；（e）AuNP−SWCNT在溶酶体腔内的TEM图像；（f）每个溶酶体细胞器内AuNP−SWCNT相对频率分布直方图；（g）实验中测得的AuNP−SWCNT的频率分布直方图以及预测的游离AuNP频率分布直方图ss(GT)6-(8,6)的生物相容性为了评价ss(GT)6-(8,6)复合物在哺乳动物细胞内的生物相容性。作者们首先利用0.2 mg/L的annexinV和PI进行实验，结果表明ss(GT)6-(8,6)复合物不会影响细胞的存活和增值。TEM结果也表明ss(GT)6-(8,6)不会影响内体性溶酶体细胞器的形态。更高浓度（1 nm/L）的ss(GT)6-(8,6)复合物的含量也不会影响内溶酶体细胞器的通透性。作者们为了评价ss(GT)6-(8,6)复合物是否会影响内溶酶体维持自身pH的能力，便采用特异性吸附到酸性小泡内部的一种内溶酶体荧光探针（LysoTracker）对细胞内pH水平的变化进行了评价，结果显示，无论是添加或不添加ss(GT)6-(8,6)复合物，LysoTracker的荧光强度均无显著差异。作者们还探究了添加DNA-CNTs对溶酶体水解脂类蛋白的影响，作用1 mg/L的Alexa-SWCNTs处理U2OS-SRA细胞，并在细胞培养液中添加50 μg/mL的Alexa 488-AcLDL以诱导细胞吸收脂类蛋白。研究表明，添加或不添加DNA-CNTs的细胞在脂类分解水平上没有差异。此外，脂质生化分析也表明，包含CNTs的细胞与不含CNTs的细胞的胆固醇和总脂质含量均无明显差异，脂毒素成像与低密度脂蛋白受体的表达也表明ss(GT)6-(8,6)复合物不会影响细胞器对细胞内脂质的处理（图5）。

图5：ss(GT)6-(8,6)复合物对溶酶体功能的影响；（a）在U2OS-SRA细胞中LysoTracker-Red (绿)，Alexa 647-SWCNT(红)和合并图的共聚焦荧光成像；（b）沿合并图像中虚线分布的两个荧光图荧光强度；（c）包含Alexa 647-SWCNT和不包含Alexa 647-SWCNT的辐射强度；（d）包含Alexa 488-AcLDL和不包含Alexa 488-AcLDL的U2OS-SRA细胞荧光成像；（e）感兴趣区域的Alexa 488-AcLDL数量高光谱显微镜监测溶酶体内腔脂质含量的变化为了测定脂质在溶酶体细胞内的积聚，作者先用U18666A或Lalistat 3a2对RAW 264.7巨噬细胞进行预处理，后与ss(GT)6-(8,6)复合物在37oC下培养，以未经预处理的巨噬细胞作为空白对照。采用高光谱显微镜对上述三种细胞进行成像，与对照组相比，两种经预处理之后的细胞发生了蓝移，两种细胞中都含有ss(GT)6-(8,6)复合物。核内质溶酶体脂质图谱反映了ss(GT)6-(8,6)复合物对核内溶酶体腔内脂质积聚的光学响应，作者建立了一个关于CNTs发射峰值与脂质浓度之间的关系，对于U18666A处理过的细胞而言，NCP1蛋白的表达受到了阻碍，游离的胆固醇开始在溶酶体内腔积累，从而使得游离的胆固醇附着在ss(GT)6-(8,6)复合物的表面，导致CNTs发射峰蓝移。同样地，对于Lalistat 3a2处理过的细胞而言，更多游离的胆固醇脂附着在CNTs的表面，导致CNTs的发射波长发生蓝移。因此，作者发现通过溶剂化变色作用，ss(GT)6-(8,6)复合物可以作为内溶酶体脂质含量变化的指示器（图6）。

图6：活细胞内溶酶体脂质积累的监测；（a）ss(GT)6-(8，6)复合物在U18666A或Lalistat 3a2预处理过的巨噬细胞示意图；（b）RAW 264.7巨噬细胞的高光谱图像NCP1型成纤维细胞的脂质含量的测定及单细胞细胞器内脂质含量的量化作者评估了ss(GT)6-(8,6)复合物在NPC1型溶酶体脂质储存障碍型疾病患者原代纤维细胞中的脂质积累变化的响应，高光谱数据表明，ss(GT)6-(8,6)在NPC1成纤维细胞中平均蓝移6 nm，野生型成纤维细胞内溶酶体细胞器的脂质含量比较均匀，而NPC1细胞内的辐射分布较广。为了测试ss(GT)6-(8,6)复合物的可逆性，作者用羟丙基β-环糊精对NPC1细胞进行处理，处理之后的高光谱图像表明，来自先前蓝移的NPC1细胞的报告基因发生了显著的红移。作者们还对该复合物进行了单细胞动力学测试，使用ACLDL和U18666A对细胞进行脂质积累诱导，并使用高光谱图像检测细胞内脂质含量的变化，研究表明，单个细胞的平均发射波长均发生蓝移，并在90min达到平衡，细胞内脂质积累的时间常数平均约为40min，呈对数正态分布。在证明了ss(GT)6-(8,6)复合物可以在单细胞水平上可以监测脂质的积累后，作者们还对该ss(GT)6-(8,6)复合物在细胞器水平上定量监测脂质积累的能力进行了研究，采用高光谱图像技术对骨髓来源的单核细胞向巨噬细胞转化的过程中，溶酶体内单个细胞器脂质含量变化的差异性进行了监测（图7）。

图7：定量测定单核细胞内溶酶体细胞器内脂质的差异性；（a）近红外高光谱的宽场叠加图像；（b）两种细胞的内溶酶体脂质高光谱图像；（c）ss（GT）6-(8，6)复合物在两种细胞的发射像素点内的频率分布直方图概而论之，本工作作者们构建了一种溶酶体脂质通量变化的“光学报告器”，该“光学报告器”可以准确的定位在细胞的溶酶体内腔，而对细胞的正常生理过程没有影响，借助于高光谱显微镜，可以绘制出细胞及细胞器内脂质含量的图像。本工作作为首次报道测量细胞内溶酶体脂质通量的文章，有望在未来脂质类药物的筛选和脂质相关疾病的探索研究中发挥重大作用。

参考文献

[1] Jena P V, Roxbury D, Galassi T V, etal. A carbon nanotube optical reporter maps endolysosomal lipid flux[J]. ACSNano, 2017 11(11) 10689-10703.

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