Nano Letters：DNA长度决定着细胞内SWCNTs的“命运”

单壁碳纳米管（SWCNTs）因在近红外（NIR）区域有稳定的光致发光特性而在生物成像领域应用颇多。单链DNA可以通过非共价键与SWCNTs结合（DNA-SWCNTs），使SWCNTs有更好的生物相容性。研究表明，SWCNTs进入人体之后，会被巨噬细胞“内化”，并在溶酶体定位。对SWCNTs的表面进行修饰，可以改变SWCNTs在细胞内的“命运”。但是，人们对DNA单链的长度如何影响DNA-SWCNTs在复杂细胞环境中的代谢知之甚少。

2019年3月，美国罗德岛大学Daniel Roxbury教授课题组在《Nano Letters》发表题为“Biomolecular Functionalization of a Nanomaterial To Control Stability and Retention within Live Cells”的文章，介绍了DNA-SWCNTs与细胞之间相互作用的关系。

DNA单链的长度与DNA-SWCNTs荧光强度的关系

为了研究DNA单链的长度对DNA-SWCNTs光学特性的影响，作者先用五种单链DNA（(GT)n，n=6，9，12，15，30）对SWCNTs进行修饰，后与小鼠巨噬细胞一起培养30分钟（(GT)n-SWCNTs浓度：1mg/L）。当用730 nm激光激发时，大多数细胞表现出明亮的宽频发射（900-1600nm），说明DNA-CNTs被细胞“内化”。作者探究了荧光强度与DNA单链的长度和时间的关系，结果显示，DNA-SWCNTs荧光强度与DNA单链长度成正比而与时间成反比。有趣的是，具有较长DNA单链的DNA-SWCNTs的初始的荧光强度分布较广，说明长链DNA使DNA-SWCNTs对近红外光更敏感。作者对细胞内DNA-SWCNTs的荧光强度进行了量化并计算了细胞内的平均荧光强度，发现细胞内的荧光强度随着DNA链长的增加而增加，皮尔森相关系数分别为0.846、0.885和0.850，证实两者线性相关且具有统计学意义（图1）              

图1：DNA-SWCNTs的荧光强度与DNA单链长度的关系；（a）(GT)15-SWCNTs的荧光图像、白光图像和整合的荧光/白光图像；（b）DNA-SWCNTs的荧光图像；（c）DNA-SWCNTs荧光强度柱形图；（d）DNA-SWCNTs的平均荧光强度

DNA-SWCNTs荧光强度与DNA单链长度和SWCNTs手性的关系

为了进一步比较SWCNTs手性与荧光稳定性的关系，作者将发射中心波长转化为能量，并将DNA-CNTs的荧光强度与对照组做了对比。研究表明，5种DNA-SWCNTs中，只有(GT)6-SWCNTs荧光强度随时间的延长而增加，其他4种DNA-SWCNTs的荧光强度有适度的损失。对于某一种手性的SWCNTs而言，(GT)n-SWCNTs荧光强度损失没有在同一时间段内发生，说明荧光强度的损失是多种因素的结果。为了在单细胞水平上研究光谱位移，作者利用高光谱技术绘制了(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的高光谱图像，并将高光谱图像中每一个包含SWCNTs像素点拟合到洛伦兹曲线上，用(94)-SWCNTs的中心辐射能量图覆盖白光图，并为每个图像构建直方图以描述细胞内SWCNTs发射能量的变化。作者发现，0h的时候，(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的荧光强度在统计意义上完全相同。将直方图进行高斯拟合，可以通过半全宽来评估总体的异质性。研究表明，内化后(GT)6-SWCNTs的半高宽是(GT)30-SWCNTs的两倍，且(GT)30-SWCNTs的辐射强度不随时间变化。6 h后，(GT)6-SWCNTs的发射能量降低了8 meV，半高宽降低了50%。作者认为，这种近红外光荧光强度的变化是DNA-SWCNTs复合物的DNA单链末端相对丰度变化的结果，对于DNA-SWCNTs中一定质量的DNA，(GT)6-SWCNTs中DNA单链数是(GT)30-SWCNTs的5倍（图2）。

图2：荧光强度与DNA单链的长度和SWCNTs手性的关系；（a）细胞内荧光强度的热图；（b）(GT)6-SWCNTs和（c）(GT)30-SWCNTs的白光图和高光谱图像的叠加图和荧光能量分布直方图

细胞内DNA-SWCNTs荧光强度的稳定性

被细胞内化的DNA-SWCNTs的光谱稳定性有较大差异。作者基于SWCNTs对常规有机荧光团的淬灭效应，设计了一种检验DNA-CNTs完整性的方法。实验人员首先用Cy3对(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs进行标记，脱氧胆酸钠（SDC）小分子通过竞争机制取代Cy3-DNA附着在SWCNTs的表面，使原来发生荧光淬灭效应的SWCNTs重新发出明亮的荧光。尽管SDC的置换动力学不相同，但Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的荧光淬灭动力学是相似的。当用含有Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的细胞培养物培养巨噬细胞时，Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的荧光淬灭现象有很大的不同，Cy3-(GT)6-SWCNTs很快的发生荧光淬灭并在4 h达到最大荧光强度，24h后降至初始荧光强度；相比之下，Cy3-(GT)6-SWCNTs则在任何时间段均未观察到荧光淬灭现象（图3）。

图3：DNA-SWCNTs在细胞内的稳定性；（a）实验设计示意图：SWCTNs被DNA单链紧密包裹时，未发生荧光淬灭现象，DNA单链解离时发出强烈荧光；（b）荧光强度随SDC小分子置换时间的增加而增加；（c）用Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs培养的RAW 264.7细胞的白光图和荧光图的叠加；（d）平均荧光强度直方图

细胞对DNA-SWCNTs的“内化”和“外排”

尽管SWCNTs的荧光强度受到浓度和局部环境的影响，但是SWCNTs的某些特征只和浓度有关，这就意味着，无论样本的荧光强度如何，SWCNTs的手性信息在拉曼图谱中都可以被表达出来。作者使用共聚焦拉曼显微镜评估了SWCNTs在细胞内的局部浓度，首先使用1mg/L的Cy3-(GT)6-SWCNTs或Cy3-(GT)30-SWCNTs培养巨噬细胞30分钟，对0.5μm的微小区域进行拉曼成像。为了计算出每个细胞内SWCNTs的质量，作者得出了G峰与SWCNTs浓度的特征曲线。Cy3-(GT)6-SWCNTs培养的巨噬细胞中SWCNTs的起始浓度是Cy3-(GT)30-SWCNTs培养的巨噬细胞的两倍；24 h后，Cy3-(GT)6-SWCNTs培育的巨噬细胞内SWCNTs的浓度下降了75%，而Cy3-(GT)30-SWCNTs培育的巨噬细胞内SWCNTs的浓度下降较小。作者将Cy3-(GT)6-SWCNTs培育的巨噬细胞内SWCNTs的起始浓度高的原因归结于单根SWCNTs上的DNA密度较大，这增加了细胞膜蛋白与DNA相互接触的概率；相反，也正是由于膜蛋白与DNA接触概率的增大，从而使得巨噬细胞可以更快的以胞吐的形式“释放”SWCNTs。

为了更好的理解胞吐机制，作者对细胞“释放”(GT)6-SWCNTs的途径进行了探究。作者设计了一个实验，用巴弗洛霉素A1和诺考达唑（两种抑制细胞溶酶体胞吐作用的化学药物）对巨噬细胞进行了处理，并比较细胞内DNA-SWCNTs的浓度。结果显示，(GT)6-SWCNTs在细胞内的浓度高于对照组，(GT)30-SWCNTs的浓度与对照组相比变化不大；相反，用布雷非德菌素A和Exo1（两种抑制高尔基体分泌的化学药物）对巨噬细胞进行处理，结果显示，(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的浓度与对照组相比差异性较小；这说明细胞主要是通过溶酶体的胞吐作用来实现DNA-CNTs的“释放”（图4和图5）。

图4：通过共聚焦显微镜确定SWCNTs的浓度；（a）Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs培养的RAW 264.7细胞的G峰强度图和白光图（b）从细胞中ROI区域像素点计算得出的SWCNTs的浓度；（c）被细胞内化的SWCNTs的比值；（d）细胞上清液中外源性SWCNTs的浓度；（e）共聚焦拉曼光谱G峰强度图与白光图的叠加；（f）在（e）图中包含SWCNTs的所有像素点的平均浓度

溶酶体胞吐的主要功能之一是分泌各种生物大分子，如蛋白质、酶和抗原，以进行细胞之间的信息传递，也可使周围细胞产生免疫反应。有研究表明，对SWCNTs的表面进行修饰可以有效降低对细胞的毒性，原始的SWCNTs与细胞膜上的受体相互作用之后会被认为是一个有害物质。因此，作者认为溶酶体将DNA链段从DNA-SWCNTs复合物上去除后，会使得细胞将“裸露”的SWCNTs当做异物，而引发细胞的胞吐作用将其排出，导致细胞内SWCNTs的浓度降低；而长链的DNA对SWCNTs的包覆比较严密，溶酶体无法将DNA-SWCNTs复合物上的DNA“剔除”，从而无法产生胞吐作用，这会导致(GT)30-SWCNTs在细胞内的滞留。

图5：DNA长度相关性的细胞内加工示意图；（a）巨噬细胞将(GT)6-SWCNTs复合物内化并在溶酶体内定位，随后生物分子与DNA链发生交换，并迅速诱导溶酶体胞吐；（b）巨噬细胞将(GT)30-SWCNTs复合物内化并在溶酶体内定位，而DNA-SWCNTs的完整性使SWCNTs被长时间保留在细胞内

总结：作者借助于可见-近红外高光谱成像和共聚焦拉曼显微技术，发现DNA单链的长度对DNA-SWCNTs的光学稳定性有影响，通过调节DNA单链的长度可以实现对细胞“摄入”和“外排”SWCNTs的调节；DNA-CNTs上较短的DNA单链在溶酶体内被细胞的生物小分子取代，改变了SWCNTs的物理特性和在细胞内的“命运”；最后通过药物实验证实了细胞对SWCNTs的“外排”是通过胞吐作用。这些发现有助于人们进一步理解SWCNTs与细胞之间的相互作用，也为后续科研人员进一步探究细胞对官能化小分子的“响应性”奠定了理论基础。

参考文献

[1] Gravely M, Safaee M M, Roxbury D.Biomolecular Functionalization of a Nanomaterial To Control Stability andRetention within Live Cells[J]. Nano Letters, 2019, 19(9) 6203-6212.

想了解更多动物实验的前沿仪器，近红外及高光谱前沿技术请咨询北京心联光电科技有限公司