高光谱暗场成像用于胞嘧啶修饰位点的量化研究
表观遗传信息的调控和异常在众多的生理、病理中起着至关重要的作用。胞嘧啶衍生物可以调控基因表达。但是,单细胞水平上遗传信息标记物的定量评估受到了较低的时空分辨率和信噪比成像方法的限制。所以,很少有人对不同类型细胞和不同细胞阶段的这些胞嘧啶修饰位点进行表征研究。
高光谱成像技术(Hyperspectral Imaging)有着极高的空间分辨率和光谱分辨率,可以轻松获得视野内上某一个像素点的光谱信息。暗场成像(Dark-Filed)的方式可以排除未散射的入射光束,得到清晰的背景。将高光谱成像技术与暗场成像方式相结合(Hyperspectral Dark-Field Imaging,HSDFI)可以确定生物组织中等离子体纳米颗粒的位置和成分。2015年,美国普渡大学JosephIrudayaraj课题组在《ACS Nano》上发表文章“Single-CellQuantification of Cytosine Modifications by Hyperspectral Dark-Field Imaging”,提出了一种在单细胞水平上检测胞嘧啶修饰位点的方法。具体内容如下:
等离子体纳米探针用于胞嘧啶修饰的检测
作者选用DNA修饰的一抗和包含AuNPs和AgNPs的二抗来平衡空间位阻,结合效率和信噪比。等离子体纳米探针具有较大的局部表面等离子体共振(Local Surface Plasmon Resonance,LSPR)散射截面,这些纳米探针作用于胞嘧啶的修饰位点会产生强信号。通过分析LSPR光谱特征和信号强度,可以得出等离子体纳米探针的数量和局部浓度,进而对单细胞内胞嘧啶修饰位点的平均数量和区域分布进行量化。AuNPs的LSPR峰位于537nm附近呈现绿色,AgNPs位于419nm附近呈现蓝色。这组体外光学实验验证了这组纳米粒子用于检测DNA上胞嘧啶修饰位点的可行性(图1,图2)。
图1:胞嘧啶修饰位点的成像和量化示意图;(a)抗体修饰胞嘧啶位点原理图;(b)单细胞内胞嘧啶修饰位点和局部修饰的浓度的高光谱信息
图2:AuNPs和AgNPs的高光谱暗场成像和光谱表征示意图
单细胞内胞嘧啶修饰位点的量化
对胞嘧啶修饰位点进行检测可以评估量化效率。作者检测了5caC的细胞周期依赖性丰度。尽管在体细胞中,5mC的图像可以在新合成的DNA链上重建,但是目前还不清楚其他改性的胞嘧啶的丰度是否也能在“后代”中稳定的遗传。因此,作者进行了实验来评估不同细胞阶段的5caC水平。研究表明,5caC在G2M阶段的含量是G1的两倍。单个染色体上的5caC的局部浓度也可以用HSDFI进行绘制,5caC在着丝粒处的密度明显高于端粒处,重构的光谱图也进一步证实了细胞核和单个染色体上的5caC的密度(图3)。
图3:5caC在MCF-7细胞的不同阶段的成像和量化;(a)样品细胞在G2/M阶段和G1阶段的高光谱暗场图像;(b)不同细胞期5caC的数量;(c)5caC在单条染色体分布的高光谱暗场图像;(d)端粒和着丝粒上纳米探针的LSPR谱图;(e)5caC在单条染色体上分布的荧光成像;(f)5caC在细胞核和单条染色体上的光谱重建图像
HSDFI精确性的验证
为了证明HSDFI的精确性,作者选用两种细胞系对胞嘧啶的修饰位点进行了实验(5caC在HeLa细胞和SF767细胞,5fC在HeLa细胞),并使用HSDFI的滤波功能可以对胞嘧啶改性的DNA进行量化。研究表明,5caC在SF767细胞和Hela细胞的比值约为1.97,SF767细胞中5caC水平高于5fC,比值约为1.56,这些结果说明了5caC比5fC更稳定(图4)。
图4:HSDFI的滤波功能可以实现胞嘧啶修饰的精确量化;(a)利用HSDFI的滤波功能对原始图像进行优化;(b)不同细胞纳米粒子的高光谱图像和数量
胞嘧啶修饰位点的多重检测
为了评估HSDFI用于多重检测的有效性,作者选用30nm的AuNPs和20nm的AgNPs进行了实验。根据散射光的颜色和光谱特征来区分纳米探针(绿色为AuNPs,蓝色为AgNPs)。纳米粒子的位置信息和相互作用可以用HSDFI成像技术来分析。高光谱图像上AgNPs和AuNPs的LSPR峰位没有发生偏移,纳米粒子之间的间距约为1 nm,说明AuNPs和AgNPs没有发生耦合和团聚,耦合之后的峰形明显的偏移。这些结果表明HSDFI可以评估表观遗传修饰位点的数量和相互作用(图5和图6)。
图5:AuNPs和AgNPs的表征;(a)纳米粒子的暗场成像;(b)AgNPs和AuNPs的红外谱图
图6:细胞中5caC和5mC的检测;(a)5caC和5mC的高光谱图像;(b)a图中圈内三个点的光谱信息;(c)b图中的模拟光谱图;(d-g)光谱谱线信息的二维图像
总结:作者进行一系列的实验证明了HSDFI可以在单细胞水平上对多重表观遗传标记的修饰位点进行量化和成像。这是单细胞表观遗传学定量领域的首次尝试之一,为未来临床诊断中更全面的细胞分析和组织评估奠定了基础。
参考文献
[1] X, Wang, Y. Cui, and J. Irudayaraj. Single-CellQuantification of Cytosine Modifications by Hyperspectral Dark-Field Imaging[J]. ACS Nano, 2015, 9(12): 5b04451.
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